Biotecnologie

Possiamo definire le Biotecnologie come un insieme di tecniche applicate alla Biologia, in particolare quelle tecniche che utilizzano organismi viventi e loro derivati per produrre una sostanza specifica o per raggiungere un obbiettivo prefissato.

Le applicazioni di queste biotecniche sono fatte nel campo dell'ingegneria genetica, che interviene per modificare specifici geni presenti in un organismo. 

Il termine biotecnologia viene coniato per la prima volta all'inizio del Novecento, ma le biotecnologie non sono una scoperta recente, come è solito pensare. 

Già 4mila anni fa, le civiltà Sumere e Egizie utilizzavano i lieviti nel processo di fermentazione della birra. A quest'epoca risalgono anche i formaggi, lo yogurt e il latte fermentato, tutti prodotti grazie a microrganismi.

Nell'800 vengono sviluppate le biotecnologie classiche, che gettano le basi per lo studio della biologia moderna. Per primo Louis Pasteur, che viene considerato il padre della microbiologia moderna, studiò le molecole biologiche alla base dei processi biologici, cancellando il mito della generazione spontanea (teoria per la quale la vita si genera in modo spontaneo da componenti inanimate).

Un altro importante esponente fu Alexander Fleming, che nel 1928 scoprì la penicillina, dando origine alla produzione di molecole ottenute grazie al metabolismo dei microrganismi.

In seguito, dagli anni '40 in poi, si aprì l'era della genetica moderna. Le tecnologie erano sufficientemente evolute da permettere lo studio di nuove tecniche genetiche, dando vita alle biotecnologie moderne.

Nel 1969 si ha la prima sintesi in vitro di un enzima. Negli anni '70 furono scoperti gli enzimi di restrizione e venne elaborata la tecnica della clonazione. Verso la fine del '900 si riuscì anche a produrre in modo sintetico proteine, tra cui importanti enzimi e ormoni.

Nel 1978 venne prodotta l'insulina e nel 1979 l'ormone della crescita. 

Negli anni '80 nacque la PCR e le basi per i primi OGM. Negli anni '90 si sviluppo il progetto genoma umano, una delle prime terapie geniche applicate all'uomo. Nel 1997 nacque Dolly, la prima pecora clonata da cellule adulte. 

Oggi le biotecnologie sono utilizzate ancora nell'ambito dell'ingegneria genetica, nella produzione di OGM e si prevede un loro utilizzo per la produzione di farmaci mirati e per la produzione di energia rinnovabile.

Si definisce tecnologia del DNA ricombinante l'insieme di tecniche che consentono di isolare corte sequenze di DNA per inserirle o trasferirle in un altro organismo, modificandone uno o più geni.

Utilizzando questa tecnica si possono modificare geni specifici e ricombinarli con il materiale genetico di altri organismi, incrociando anche il genoma di individui di specie diversa.

La tecnica del DNA ricombinante si basa su un procedimento semplice:

1. Riconoscere del gene specifico.
2. Targliare il gene utilizzando specifici enzimi.
3. Isolare il gene dal restante DNA.
4. Inserire il gene in un vettore (anch'esso costituito da DNA).
5. Trasferire il vettore in una cellula vivente.

Per tagliare il DNA sono necessari specifici enzimi, chiamati enzimi di restrizione. 

Questi enzimi sono in grado di riconoscere una specifica sequenza di basi sul filamento di DNA, chiamata sequenza di riconoscimento o meglio sito di restrizione.

Ogni enzima di restrizione ha un sito specifico e agisce rompendo i legami tra il gruppo ossidrile e il gruppo fosfato di due estremità di un nucleotide (vedi molecole biologiche). 

Gli enzimi di restrizione solitamente agiscono su DNA esterno, cioè non attaccano il DNA presente nella cellula che li ha prodotti, grazie ad un processo chiamato metilazione che protegge il DNA aggiungendogli un gruppo metile. 
Gli enzimi vengono quindi isolati ed estratti dalla cellula che li produce, per essere utilizzati come "forbici" che effettuano un taglio obliquo nel filamento di DNA.

I tratti di DNA ottenuti grazie a questo processo prendono il nome di frammenti di restrizione.  Dal momento che le sequenze specifiche di DNA non si trovano alla stessa distanza sul filamento di DNA i frammenti di restrizione avranno lunghezze diverse, caratteristica che permette di isolarli. 

La tecnica utilizzata per isolare e purificare i frammenti di restrizione prende il nome di Elettroforesi su gel.

In uno stampo rettangolare viene posto un gel di agarosio, un polisaccaride che si ottiene dalle alghe. In questo gel si trovano delle piccole cavità, chiamate pozzetti. All'interno di questi pozzetti vengono disposti (caricati) i campioni da analizzare.

Al gel viene poi applicato un campo elettrico che è in grado di trascinare il DNA verso l'entremità opposta ai pozzetti (polo positivo) dal momento che il DNA possiede carica negativa.

I frammenti più grossi e più pesanti faticheranno a passare attravero la rete creata dal gel di agarosio, mentre i frammenti più piccoli riusciranno a continuare la corsa, disponendosi più lontano.A fine corsa il campo elettrico viene interroto, dopo un preciso lasso di tempo.

Utilizzando un colorante che diventa fluorescente alla luce UV è possibile osservare i frammenti, che appaiono come bande.

Si possono poi osservare la dimensione dei frammenti, utilizzando un frammento di riferimento con dimensioni note, oppure la presenza di determinate sequenze di DNA estraendo il frammento e analizzandolo. 

Le estremità dei frammenti di restrizione prendono il nome di estremità coesive, estremità sfasate a filamento singolo che sono capaci di legarsi ad una nuova sequenza di DNA.

Come i pezzi di un puzzle, sono in gradi di incastrarsi tra loro oppure unirsi ad un'altra sequenza di materiale genetico.

Le sequenze sono poi legate tra di loro attraverso enzimi specifici. Questi enzimi, sempre presenti nella cellula perché partecipano alla duplicazione del DNA, prendono il nome di DNA ligasi. Alcune ligasi possono unire anche frammenti con estremità "piatte". 

Grazie a questi enzimi è possibile inserire i frammenti di restrizione in altri organismi e "cucirli" al loro genoma.

Il primo OGM è stato ottenuto nel 1973 da S. N. Cohen e H. Boyer che furono in grado di clonare un gene di rana all'interno del batterio Escherichia coli, in seguito negli anni '70  utilizzando lo stesso batterio furono in grado di riprodurre le proteine insulina e somatostatina. 

Gli OGM sono organismi il cui patrimonio genetico è stato modificato tramite tecniche di ingegneria genetica che consentono l'aggiunta, l'eliminazione o la modifica di elementi genetici. 

Questi nuovi organismi vengono creati attraverso l'introduzione di materiale genetico in un organismo "ricevente", nel quale è possibile la replicazione. Per queste operazioni vengono solitamente utilizzati i plasmidi batterici. 

Gli scopi per la produzione di OGM sono vari. Lo scopo principale è quello di migliorare le produzione e i prodotti.

Sugli Animali le ricerche sono finalizzate alla produzione di proteine umane, anticorpi e vaccini. Si sta per esempio lavorando sulla produzione da parte dei mammiferi ad un latte privo di lattosio. Nei pesci si agisce per favorire uno sviluppo più rapido e sul raggiungimento di dimensioni maggiori. Altri animali transgenici sono gli Oncotopi, utilizzati per gli studi sul cancro. 

Un altro ambito in ampliamento è quello degli xenotrapianti, cioè i trapianti di organi da una specie non umana. L'ingegneria genetica sta lavorando per sopprimere le reazioni anticorpali che causano il rigetto dell'organo trapiantato.

Nei Vegetali si lavora per migliorare le produzioni alimentari e per attribuire alle piante resistenze a particolari agenti. Tra le piante transgeniche troviamo mais Bt, resistente agli insetti,  e la soia che resiste agli erbicidi, prodotte specialmente nel Nord America. Si lavora anche a piante che possano produrre farmaci o vaccini, piante resistenti ai climi eccessivamente freddi o secchi e piante che riescono a resistere alle infezioni virali o batteriche. 

Le applicazioni sono quindi in ambito agricolo, alimentare, indrustriale e medico. 

La procedura per la produzione di OGM segue quella della tecnica del DNA ricombinante:

1. Isolamento del gene da trasferire utilizzando un enzima di restrizione.
2. Inserimento del gene isolato in un vettore, che può essere un plasmidio batterico o un virus, oppure direttamente in una cellula (animale o vegetale che si trova in coltura).
3. Replicazione della cellula o del vettore, in modo da ottenere più copie del gene da trasferire.
4. Trasferimento del gene in un organismo, ottenendo così il nuovo individuo con capacità modificate.

Solitamente questi meccanismi vengono applicate alle cellule vegetali, che sono totipotenti, cioè in grado di generare totalmente un nuovo organismo.

Le tecniche che consentono l'inserimento di un gene esterno o di un plasmide all'interno di un batterio, di una cellula vegetale, di una cellula animale o all'interno di un  protoplasto (cellula privata della membrana e della parete) sono varie:

• Elettroporazione
• Metodo Biolistico
• PEG
• Utilizzo di Agrobacterium
• Microiniezioni
• Coniugazione
• Fusione di Protoplasti
• Utilizzo di Sali

L'Elettroporazione è una tecnica che viene solitamente applicata ai protoplasti, dal momento che non possiedono la membrana, motivo per cui dopo diventa difficoltoso far crescere un nuovo organismo.

Questa tecnica consiste di sottoporre a shock elettrico una soluzione contenente cellule e frammenti di DNA. In questo modo le membrane cellulari vengono rese permeabili (i pori della membrana di aprono per via dello shock), consentendo al DNA di entrare nella cellula.

Le cellule vengono poi fatte crescere in coltura e solo quelle contenenti il nuovo materiale genetico vengono selezionate.

Il Metodo Biolistico è una tecnica in cui il DNA viene fatto aderire a microsfere di tungsteno o d'oro, che vengono sparate direttamente sui campioni da trasformare. Alcune cellule vengono uccise, mentre in altre i proiettili riescono a penetrare. 

Questa tecnica può essere utilizzata su cellule vegetali provviste di membrana e per colture embrionali.

La PGE o Polietilenglicolie consente di inserire direttamente DNA plasmidico nelle cellule. Attraverso emulsionanti, rende permeabili le membrane cellulari all'ingresso del materiale genetico.

Il batterio Agrobacterium tumefaciens contiene il plasmide Ti, che è capace di integrarsi in modo efficiente all'interno del genoma vegetale.

Questo plasmide attribuisce al batterio la capacità di provocare tumori. Grazie all'ingegneria genetica, i tratti del plasmide responsabili della malattia sono stati eliminati e sostituiti con dei geni da trasferire. 

Viene utilizzato anche il batterio Agrobacterium rhizogenes, che induce invece la produzione di radici, favorendo la rigenerazione degli organismi.

Le Microiniezioni (utilizzate anche per la fecondazione artificiale) prevedono l'inserimento di piccole quantità di DNA in una cellula animale, attraverso una microsiringa. Solitamente il DNA viene inserito nell'Ovocita appena fecondato e viene integrato nel genoma della cellula che, trapiantata in un organismo ricevente, consente lo sviluppo di un animale transgenico.

Generalmente il DNA estraneo viene trasferito al 10-30% della prole.

La Coniugazione è il processo che i batteri utilizzano per scambiarsi materiale genetico (vedi variabilità genetica). Attraverso questo processo un plasmide (e la caratteristica che codifica) può essere trasmesso da una cellula ad un'altra.

La Fusione dei Protoplasti è una tecnica utilizzata per produrre ibridi cellulari. 

Le cellule vengono private delle pareti cellulari e  trattate con PEG e sali di calcio e magnesio. In questo modo vengono uniti i citoplasmi e i nuclei cellulari. In questo modo il patrimonio genetico viene rimescolato.

Attraverso l'Utilizzo di Sali invece si creano pori nelle membrane cellulari, in modo tale da renderle permeabili al DNA esterno. In particolare vengono utilizzati CaCl2 e Ca3(PO4)2.

Ottenuto l'OGM è necessario purificarlo e isolare solo il carattere interessato.

Solitamente per fare questo tipo di operazione vengono impiegati Anticorpi Monoclonali, cioè anticorpi con una elevata specificità.
Questi anticorpi vengono prodotti iniettando un antigene in un topo e fondendo le cellule anticorpali con quelle tumorali. Dopo vengono individuate le cellule che hanno mantenuto la capacità di produrre anticorpi, ottenendo così una riserva inesauribile.

Un'altra tecnica utilizzata per individuare l'organismo che contiene il gene desiderato è quella delle Sonde Molecolari, che sono in grado di individuare una determinata sequenza di basi e formare legami idrogeno con essa.

Abbiamo infine i Geni Marker o Reporter, geni che vengono introdotti nelle cellule e nei protoplasti assieme ai frammenti di materiale genetico. Questi geni conferiscono agli organismi la capacità di resistere a determinate tossine. Trattando tutte le cellule con tossine o anticorpi, solo le cellule contenenti i frammenti di DNA (e quindi anche i geni marker) sopravivranno al trattamento, e potranno quindi essere isolate.

Dopo essere penetrato nella cellula il DNA estraneo deve anche essere in grado di duplicarsi. Per poter fare questo il nuovo DNA deve far parte di un replicone, cioè un segmento di DNA che contenga un'origine della duplicazione. Qui può inserirsi in un cromosoma che si trova in prossimità del sito di origine oppure penetrare come parte di una sequenza di DNA appartenente ad un vettore, che possiede già un punto di origine della duplicazione. 

Perché sia efficace, un vettore deve essere in grado di duplicarsi in modo autonomo rispetto alla cellula, possedere una sequenza riconoscibile dagli enzimi di restrizione e possedere un gene reporter che permetta l'identificazione.

Solitamente i vettori utilizzati sono i plasmidi, i virus e i cromosomi artificiali di lievito.

I Plasmidi hanno piccole dimensioni e solitamente contengono una sola sequenza riconoscibile dagli enzimi di restrizione. Molti plasmidi contengono anche geni che provocano la resistenza agli antibiotici, che essere utilizzati come geni marker.

I Virus possiedono già la capacità di infettare una cellula, iniettando all'interno di essa il proprio materiale genetico, ragione che li rende ottimi vettori.

I Cromosomi artificiali di Lievito sono invece piccolissimi cromosomi sintetizzati in laboratorio che contengono già un'origine dalla duplicazione. Questi cromosomi contengono anche le sequenze di telomero e centromero, come i cromosomi delle cellule Eucarioti. Contengono inoltre geni reporter e siti attivi per gli enzimi di restrizione. 

La Clonazione è la produzione di copie identiche di un intero organismo o di una singola cellula. 

La clonazione nasce nel 1938, grazie ad un'idea dell'embriologo Has Spermann, idea che prevedeva di sostituire il nucleo di una cellula uovo con quello di una cellula somatica, permettendo lo sviluppo di un individuo geneticamente identico a quello da cui era stato prelevato il nucleo.

Nel 1952 questo esperimento fu realizzato ad opera di Robert Briggs e Thomas King, che riuscirono a trasferire il nucleo di una cellula somatica di rana ad un nuovo, senza danneggiare la cellula, grazie ad una micropipetta di vetro. 

Loro non ottennero alcun animale ma riuscirono a dimostrare che la cellula era in grado di riprodursi per mitosi. 

Nel 1970 lo stesso esperimento fu riprodotto dal biologo John Gurdon, che utilizzò una rana africana. Prima di sostituire i nuclei, il biologo distrusse il nucleo della cellula uovo sfruttando i raggi UV. Fu in grado di ricreare rane adulte perfettamente formate.

Nel 1986 Steen Willard fu in grado di clonare una pecora, utilizzando una cellula prelevata da un embrione in fase di sviluppo. 

Nel 1997 Ian Wilmut, ricercatore fu in grado di replicare una pecora a partire da cellule adulte, non embrionali. L'unica differenza con la tecnica utilizzata precedentemente fu quella di lasciare le cellule destinate alla donazione del nucleo senza nutrimenti, in modo tale da bloccarne il ciclo cellulare.  Per ottenere una ulteriore prova della clonazione la cellula fecondata venne impiantata in una pecora di razza diversa da quella di partenza. Una sola pecora su 277 sopravvisse: si trattava della pecora Dolly. 

Da allora la clonazione a avuto esiti positivi su una lunghissima lista di animali, che comprende ovini, bovini, suini, topi, cavalli, cammelli e addirittura macachi.

C'è chi ipotizza l'applicazione di questa tecnica sull'uomo, al fine riproduttivo e per ottenere organi che in caso di trapianto non creino il problema del rigetto, ma fino ad ora niente è stato sperimentato.

Molti stati vietano questo tipo di ricerche perché considerate non etiche.  

Negli anni '70, accanto alle altre ricerche sul genoma, si iniziò uno studio che si prefissava l'obbiettivo di sequenziare il DNA. Sequenziare significa determinare in che ordine sono disposti i nucleotidi nel DNA.

Dopo aver determinato le sequenze presenti si andrà a studiare qual è la loro funzione, infatti dalla sequenza dei geni è possibile ricavare:

1. Le finestre di lettura (ORF), cioè i tratti codificanti dei geni. 
   Per esempio, per i geni che codificano le proteine, questi tratti sono identificabili grazie ad un codone di inizio e uno di stop.
2. Le sequenze di amminoacidi che compongono una proteina.
3. Le sequenze regolatrici, come i promotori della trascrizione. 

Lo studio in questo campo si concentrò subito su singoli geni. Negli anni '70 divenne possibile sequenziare il DNA dei virus grazie ai progressi della tecnologia.

In seguito questo lavoro venne svolto sul DNA batterico, facile da studiare grazie alle sue dimensioni ridotte. Non era però ancora possibile sequenziare il genoma di organismi più complessi. Ciò divenne possibile solo nell'ultimo decennio, grazie allo sviluppo di tecnologie che lavoravano in modo automatico.

Il Progetto Genoma Umano è stato uno dei più grandi progetti avviati nel '900, grazie a James Watson, lo scopritore della doppia elica del DNA.

Il progetto si prefissava l'obbiettivo di sequenziare l'intero corredo cromosomico di una cellula aploide umana, comparando diversi campioni.

Il National Istitutes of Health si è preso l'incarico di frammentare l'intero genoma utilizzando enzimi di restrizione, per poi unire i diversi frammenti e ricomporre la mappa del genoma, sfruttando anche i computer avanzati della Celera Corporation, istituto privato.

Quello che è stato invece scoperto è che il genoma umano contiene 28'000-30'000 geni e che solo il 5% viene tradotto in proteine. 

Il 95% del DNA umano prende il nome di Junk DNA e non viene mai tradotto in sequenze polipeptidiche ma che corrispondono alle sequenze degli introni, dei telomeri e dei centromeri, a sequenze ripetute e a sequenze che hanno una parte importante nella regolazione genica. Sono presenti anche i trasportoni , elementi in grado di moltiplicarsi che costituiscono il 50% del DNA ma che ancora oggi non hanno rivelato un ruolo funzionale. 

Con l'avvento dell'era del sequenziamento del DNA si aprì anche l'era della bioinformatica. Era diventato infatti di vitale importanza trovare un metodo per la conservazione dei dati, per le analisi matematiche e per le analisi statistiche. 
La bioinformatica non è però la sola a fare ingresso nell'era moderna nella genetica.

Negli ultimi anni la ricerca si è concentrata sullo studio di come una cellula possa cambiare nel tempo le sue funzioni e come possa controllare i geni attivi e quelli repressi (che non si manifestano). 

In particolare, nel 1998 i ricercatori Andrew Fire e Craig Mello pubblicarono un articolo su come degli speciali RNA a doppia elica potesse silenziare i geni. Questo meccanismo venne definito interferenza dell'RNA (iRNA). 

Oggi è possibile stabilire che questo iRNA non agisce in modo diretto, ma partecipa alla produzione di piccoli tratti di RNA chiamati miRNA o microRNA. Questi tratti sono in grado di reprimere la traduzione e partecipano al controllo dell'espressione genica. 

Fin da subito questi RNA sono stati impiegati nell'ingegneria genetica e studiati per un possibile utilizzo in campo medico, in particolare per la cura di patologie come l'HIV o il cancro.